Figura 2  
 
Importante!
As pipetas devem ser estéreis e descartadas após o preparo de cada diluição.
 As amostras mais concentradas devem ser manipuladas no final do procedimento. Evita-se assim a contaminação cruzada ou o carreamento de vírus de uma mistura para a subseqüente.
 Para validar uma sessão de titulação, o teste deverá incluir uma Vacina Padrão, isto é: uma amostra referencial, com título conhecido.

A diluição seguinte (1/100) será 10-2,0 e assim por diante.

  

O Inóculo, ou seja, uma alíquota de cada diluição da vacina é injetado em substratos laboratoriais apropriados, que podem ser ovos embrionados SPF, aves suscetíveis ou cultivos celulares, de acordo com a especificidade ou sensibilidade ao agente em teste. Em paralelo, inocula-se uma solução salina estéril isenta de vírus, o Controle Negativo.
Utiliza-se uma série "n" de no mínimo 5 indivíduos para cada diluição. Decorridas 18-24 horas da inoculação, as aves, células ou
  
 
 

embriões mortos devem ser eliminados, a título de mortalidade inespecífica.


Os indivíduos inoculados são observados em intervalos regulares, e as alterações relevantes são registradas. Ao final do período de incubação, que varia de acordo com o vírus pesquisado, realiza-se o exame dos embriões ou dos cultivos celulares, registrando-se os resultados de acordo com o critério de infectividade preestabelecido.
Quando titulamos uma vacina, buscamos conhecer a maior diluição do vírus que ainda seja capaz de infectar 50% dos substratos inoculados. É a isto que chamamos de Dose Infectante Média 50%, ou simplesmente DI50. Se a mortalidade do hospedeiro for considerada como critério de positividade, adotamos a nomenclatura Dose Letal Média 50% ou DL50.
De forma análoga, quando ovos embrionados ou cultivos de tecidos são utilizados como substrato para a titulação de vacinas, o resultado será expresso em DIOE50 (EID50 - "Embryo Infectious Dose") ou DICT50 (TCID50 - "Tissue Culture Infectious Dose"), respectivamente.

O título da vacina é calculado a partir da proporção de indivíduos infectados (positivos) dentre um universo de indivíduos inoculados e corresponde à recíproca da maior diluição onde sejam observados sinais específicos de infecção em 50% dos substratos inoculados (tabela 2).

  
     
 
Tabela 2: Exemplo de titulação
  
 
 
     
 
O End Point está compreendido entre as diluições imediatamente acima e abaixo do ponto onde ocorreu 50% de positividade (neste exemplo: 10-3.0 e 10-4.0, respectivamente). O título é determinado através da aplicação de um modelo matemático, como o método de Reed and Muench:
  
     
 
 
     
 
103.0 + 100,375 = 103,38 DIOE50