Certos agentes infecciosos produzem lesões características sobre culturas de células, como a formação de placas (PFU) ou focos (FFU). Nestes casos, podemos determinar a concentração do vírus na amostra a partir de contagem ao microscópio ótico.


De uma forma geral, a vacinação contra a Doença de Marek tem se mostrado extremamente eficaz no controle desta enfermidade. No entanto, devido ao seu caráter endêmico e ao aumento progressivo da virulência das cepas de campo, os riscos de cobertura vacinal incompleta e conseqüente baixa performance estão sempre presentes.
 
 
Nos últimos anos, buscando certificar-se de que a dose de vacina fornecida às aves é adequada para conter o desafio, várias empresas adotaram procedimentos de titulação das vacinas antes do uso, seja em laboratórios próprios ou de terceiros. Em decorrência disto, por vezes nos deparamos com situações onde uma vacina apresenta resultados de titulação completamente divergentes entre laboratórios.
Como explicar resultados de titulação diferentes entre 2 laboratórios?
Para responder esta questão, é importante levar em consideração alguns fatores que contribuem para a variabilidade de resultados entre diferentes laboratórios (vide item 3.5). Mas antes, vamos rever alguns conceitos.
As vacinas contra a Doença de Marek são produzidas e tituladas em monocamadas de Fibroblastos de Embrião de Galinha (FEG), figura 3.
  
     
 

Figura 3
A multiplicação do vírus sobre o tapete celular provoca alterações morfológicas e funcionais das células, um fenômeno conhecido como Efeito Citopático (ECP).
As células infectadas pelo Herpesvírus (HV) entram em processo de degeneração, apresentam mudanças na estrutura da membrana, tornam-se refringentes, e se agrupam formando agregados ou placas visíveis ao microscópio óptico, o PFU ("Plaque Forming Unit"), ou Unidade Formadora de Placa (figura 4).
Figura 4
Em geral, os PFU's consistem de células refráteis ou fusiformes. Sincícios e corpúsculos de inclusão intranucleares também podem ser observados.
Durante a replicação "in vitro" do Herpesvírus, os focos desenvolvem-se durante 2 e 7 dias após a inoculação, dependendo da cepa, do número de passagens as quais esta foi submetida e do tipo celular.
Os 3 sorotipos do HV disponíveis em vacinas comerciais diferem entre si quanto à habilidade de infectar culturas celulares: os vírus do sorotipo 1 (ex: cepa CVI988/
 
 
Rispens) produzem focos muito muito pequenos em FEG, tendo mais afinidade por células renais de embrião (CKC). O inverso ocorre com os vírus do sorotipo 2 (SB-1, 301/B1), que desenvolvem-se melhor em fibroblastos. Já o sorotipo 3 (HVT) produz focos maiores e mais nítidos nos dois tipos celulares, normalmente evidenciados em um período de tempo mais curto após a infecção.
  
     
 
É importante lembrar que, quando titulamos vacinas liofilizadas, os PFU's são principalmente originados por partículas virais completas, desprovidas de células. No caso de vacinas congeladas, o vírus de Marek encontra-se associado às células, e portanto, os PFU's originam-se de células infectadas que carregam em seu interior partículas virais em vários estágios de desenvolvimento.
 
     
 

Consiste, basicamente, de 4 etapas:
1. Diluição seriada da amostra em intervalos decimais ou de base 4;
2. Inoculação de alíquotas de cada diluição em placas de Petri contendo monocamadas de FEG (no mínimo 4 placas por diluição);
3. Incubação das culturas infectadas em estufa à temperatura de 37ºC, em atmosfera úmida contendo 5% de CO2.
4. Contagem dos focos em todas as placas ao final do período de incubação.
O volume do inóculo, as diluições da amostra e suas respectivas contagens de PFU's (média da leitura de várias placas) constituem os dados a serem lançados na fórmula para cálculo do título por dose de vacina.
 
     
 
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